Revista de Investigación Cañetana
Universidad Nacional de Cañete, Perú
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ARTÍCULO DE INVESTIGACION
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Caracterización molecular de cepas nativas de Bacillus spp. en suelo
rizosférico en tres regiones del Perú
Molecular characterization of native strains of Bacillus spp. in rhizospheric soil
in three regions of Peru
José Alejandro Quispe Llanos
Universidad Nacional de Cañete, Perú
Facultad de Ciencias Agrarias
2002010184@undc.edu.pe
ORCID: https://orcid.org/0009-0001-0377-
7494
Mayra Alejandra Contreras Vásquez
Universidad Nacional de Cañete, Perú
Facultad de Ciencias Agrarias
2002010060@undc.edu.pe
ORCID: https://orcid.org/0009-0004-3745-
4716
Diego Alonso Meza Huamán
Universidad Nacional de Cañete, Perú
Facultad de Ciencias Agrarias
2002010143@undc.edu.pe
ORCID: https://orcid.org/0009-0000-7009-
5031
Naysha Rojas Villa
Universidad Nacional de Cañete
nrojas@undc.edu.pe
ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4716-
0098
Phillip David Ormeño Vásquez
Universidad Nacional de Cañete
pormeno@undc.edu.pe
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7920-
0261
Jossimar Raúl Vicente Berrocal
Universidad Nacional de Cañete,
rvicente@undc.edu.pe
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-0059-
0894
Recepción: 21/04/26
Aceptación:29/05/2026
Publicación: 03/05/2026
Resumen
El género Bacillus spp. comprende bacterias ampliamente empleadas como agentes de control biológico
frente a enfermedades postcosecha que afectan frutas y hortalizas durante las etapas de
almacenamiento y transporte. Estas bacterias poseen capacidad antagonista contra diversos
fitopatógenos, entre ellos Botrytis cinerea, causante de la pudrición gris en el tálamo ensanchado y
Alternaria solani, causante de manchas necróticas en la hojas. En la presente investigación se efectuó
la caracterización molecular de cepas pertenecientes al género Bacillus procedentes de tres localidades
del Perú: Huaura, Chanchamayo y Cañete. Las muestras fueron obtenidas de suelos rizosféricos
asociados a zonas agrícolas y posteriormente sometidas a procedimientos de aislamiento
microbiológico, análisis molecular basado en el gen 16S ARNr y evaluación bioinformática. Como
resultado, se obtuvieron 14 aislamientos bacterianos con porcentajes de identidad genética
comprendidos entre 92,05 % y 100 %. La identificación molecular permitió determinar la presencia de
1 cepa de Bacillus cereus, 1 cepa de Bacillus paralicheniformis, 4 cepas de Bacillus licheniformis y 8 cepas
de Bacillus subtilis. Finalmente, las relaciones evolutivas entre las cepas fueron establecidas mediante
la elaboración de un árbol filogenético.
Palabras clave: Bacillus spp; caracterización molecular; rizósfera; 16S RNAr, biocontrolador.
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Abstract
The genus Bacillus spp. comprises bacteria widely used as biological control agents against postharvest
diseases affecting fruits and vegetables during storage and transportation. These bacteria possess
antagonistic activity against several phytopathogens, including Botrytis cinerea, the causal agent of gray
mold disease in strawberries. In the present study, the molecular characterization of Bacillus strains
obtained from three regions of Peru Huaura, Chanchamayo, and Cañete was carried out. Samples
were collected from rhizospheric soils associated with agricultural areas and subsequently subjected to
microbiological isolation, molecular analysis based on the 16S rRNA gene, and bioinformatic evaluation.
A total of 14 bacterial isolates were obtained, showing genetic identity percentages ranging from
92.05% to 100%. Molecular identification revealed the presence of 1 strain of Bacillus cereus, 1 strain
of Bacillus paralicheniformis, 4 strains of Bacillus licheniformis, and 8 strains of Bacillus subtilis. Finally,
the evolutionary relationships among the isolates were established through the construction of a
phylogenetic tree.
Keywords: Bacillus spp; molecular characterization; rhizosphere; 16S rRNA, biocontroller.
1. Introducción
Los cultivos como hortalizas, verduras y frutas
presentan incidencia de fitopatógenos entre la
cosecha y el consumo, lo que genera un
importante desperdicio de alimentos y pérdidas
económicas. Se pierden alrededor del 45% de
las frutas, verduras, raíces y tubérculos
cosechados. La mayor parte de esta pérdida
ocurre durante el almacenamiento debido al
desarrollo de plagas y patógenos (bacterias,
hongos e insectos), condiciones ambientales
desfavorables (lluvia, humedad, heladas y
calor), pérdida de agua, sacarificación y
brotación (FAO, 2015).
Las bacterias del género Bacillus spp son
identificados como microorganismos seguros
para su empleo en la industria de alimentos.
Ellos ocupan el mismo nicho que muchos
patógenos y poseen la capacidad de generar
diversas sustancias bioactivas con actividad
antibiótica. Estas sustancias favorecen la
activación de diversos procesos fisiológicos en
el metabolismo de la planta hospedera, sin
implicar riesgos para el ambiente ni para la
salud humana (Maksimov et al., 2015). Además,
Bacillus spp. (es decir, B. subtilis), producen
endosporas resistentes a los tratamientos
físicos y químicos dinámicos, como el calor, la
desecación, los solventes orgánicos y la
radiación ultravioleta, que por lo tanto
mantienen su capacidad para desencadenar
respuestas de defensa en las plantas huésped,
incluso en condiciones desfavorables (Gao
et al., 2016). A su vez esto lo hace capaz de
formular y almacenar fácilmente productos
biológicos basados en Bacillus y sirve como un
potente componente bioactivo contra
patógenos (Aouadhi et al., 2016).
En la actualidad, el efecto protector de las cepas
de Bacillus se utiliza en varias especies de
plantas contra una amplia variedad de estreses
bióticos (patógenos, plagas) (Egamberdieva
et al., 2017) y abióticos (sequía, salinidad,
temperaturas extremas, metales tóxicos, etc.)
(Lastochkina et al., 2017).
El propósito del estudio es realizar la
identificación molecular de las muestras de
Bacillus spp. colectadas en suelo rizosférico de
3 regiones del Perú y la relación que existe entre
estas especies a través de un árbol filogenético.
2. Materiales y métodos
2.1. Recolección y aislamiento de suelo
La colecta de suelo rizosféricos se realizaron en
las zonas del 1) Anexo de Canín de provincia de
Huaura, distrito de Checras, 2) Sector de Kimiri
del distrito de Chanchamayo de la provincia de
Chanchamayo y 3) Anexo de Catapalla del
distrito de Lunahuaná de la provincia de Cañete.
Posteriormente las muestras fueron
procesadas para el aislamiento de cepas de
Bacillus spp. Se pesaron 10 g de muestra de
suelo rizósfericos, los cuales fueron
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suspendidos en solución salina fisiológica
estéril. Posteriormente, se realizaron diluciones
seriadas en tres series consecutivas. Las
muestras diluidas fueron sembradas en medio
de cultivo Glucosa Triptona Extracto de Carne
(TGE) e incubadas a una temperatura de 37 °C
durante 24 horas para el crecimiento
bacteriano. finalmente se seleccionaron las
colonias y se purificaron por estrías (Chávez-
Ambriz et al., 2016; Larrea-Izurieta et al., 2015).
2.2. Extracción, cuantificación y calidad de
ADN
Las cepas aisladas fueron inoculadas en medio
de cultivo sólido Luria Broth (LB) e incubadas a
37 °C durante 18 horas, según la metodología
descrita por Valdez-Núñez et al. (2020).
Posteriormente, el aislamiento del ADN
genómico se realizó siguiendo las
especificaciones y protocolos establecidos por
el fabricante del kit comercial Genomic DNA
Extraction Kit - Gram (+) Bacteria/Yeast/Fungi
(Cepham Life Sciences). Luego se realizó la
cuantificación de las muestras mediante el
espectrofotómetro Eppendorf
BioSpectrometer kinetic (Huertas, 2013) y para
verificar la calidad e integridad del ADN se
realizó una corrida de electroforesis de agarosa
al 1 por ciento en una solución de tampón que
regula el pH y ayuda que el ADN no se degrade
(Buffer TAE 1X) (Rodríguez-Tolosaa et al., 2023).
2.3. Amplificación en PCR con el gen 16S rRNA
y secuenciamiento de ADN
La amplificación se realien PCR (Clark et al.,
2019) utilizando 2 μl de la muestra de ADN con
el kit DreamTaq PCR Master Mix (2X) y los
cebadores 16S ARNr (Suárez & Yañez, 2020).
Para un control negativo se utilizó un mix sin
muestra. Las mezclas fueron llevadas a procesar
al termociclador Eppendorf Mastercycler X50s
utilizando el siguiente ciclaje: 1 ciclo de
desnaturalización inicio a 95 °C durante 3
minutos, con la finalidad de separar
completamente las cadenas de ADN molde.
Posteriormente, se realizaron 40 ciclos de
amplificación, los cuales incluyeron una fase de
desnaturalización a 95 °C para la separación de
las cadenas de ADN, seguida de una etapa de
hibridación o alineamiento de cebadores a 55
°C, permitiendo la unión específica de los
primers a la región correspondiente del gen 16S
ARNr por 5 minutos, elongación a 72°C por 1
minuto y un ciclo de la extensión final a 72°C por
15 minutos (Cattani et al., 2016). Los
fragmentos amplificados mediante PCR fueron
evaluados a través de una corrida
electroforética en gel de agarosa al 1,5 %,
utilizando como medio de migración una
solución tampón TAE 1X.y posteriormente
fueron enviados a secuenciamiento de tipo
Sanger (Tae et al., 2014) a la Universidad de
Minnesota - USA.
2.4. Análisis bioinformático
Las secuencias obtenidas se editaron con el
software Chromas con la versión 2.66
(https://technelysium.com.au/wp/chromas/)
(Rahman et al., 2014), luego fueron analizadas
con la plataforma online BLAST (Lorenz et al.,
2013) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),
posteriormente estas fueron alineadas
utilizando la herramienta ClustalW y finalmente
se realizó la construcción de un árbol
filogenético a partir del gen 16S ARNr mediante
el software MEGA 11.0.13 (Wei Wang, 2009)
(https://www.megasoftware.net/) El análisis
filogenético de las secuencias obtenidas se llevó
a cabo mediante una reconstrucción evolutiva
utilizando el método Neighbor-Joining, el cual
permitió establecer relaciones de similitud
genética entre las cepas bacterianas evaluadas.
Para determinar la confiabilidad estadística de
los agrupamientos formados en el
dendrograma, se aplicó el todo bootstrap
con 1000 repeticiones, permitiendo evaluar la
estabilidad y consistencia de cada clado
generado.
Asimismo, las distancias genéticas entre
secuencias fueron calculadas empleando el
modelo evolutivo Maximum Composite
Likelihood, utilizado para estimar el número de
sustituciones nucleotídicas ocurridas entre las
secuencias analizadas del gen 16S ARNr. Este
enfoque permitió obtener una representación
filogenética más precisa de las relaciones
evolutivas presentes entre las cepas de Bacillus
spp. evaluadas en el estudio.
3. Resultados
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3.1. Colecta y aislamiento de muestras
Se obtuvo un total de 14 aislamientos
bacterianos correspondientes a Bacillus spp.; 07
cepas fueron recolectadas en el anexo de Canín,
perteneciente al distrito de Checras, provincia
de Huaura. Asimismo, 05 aislamientos
procedieron del sector Kimiri, ubicado en el
distrito de Chanchamayo, provincia de
Chanchamayo, mientras que las 02 cepas
restantes se obtuvieron en el anexo de
Catapalla, distrito de Lunahuaná, provincia de
Cañete.
3.2. Cuantificación y calidad de ADN
Para la cuantificación de ADN de las muestras se
obtuvo un resultado promedio de 30,35 ng/μl,
con un mínimo de 21.4 nanogramos por
microlitros para las muestras N°6, N°9 y un
máximo de 39.5 ng/μl para la muestra
UNDC_05.
Mientras que en la calidad del ADN genómico
extraído se evidenciaron bandas definidas y con
un gran peso molecular que supera los 10 000
pb, las cuales indican una calidad aceptable
para la amplificación por PCR y corrobora la
cuantificación realizada previamente
Tabla 1. Cuadros de cuantificación de ADN genómico de Bacillus spp.
Código
ng/μl
A260/A280
A260/A230
UNDC_01
36,9
1,80
1,50
UNDC_02
32
1,84
1,32
UNDC_03
35
1,83
1,22
UNDC_04
30,3
1,78
1,21
UNDC_05
39,5
1,81
1,44
UNDC_06
21,4
1,89
1,09
UNDC_07
21,9
1,88
1,07
UNDC_08
27
1,85
1,03
UNDC_09
21,4
1,89
1,09
UNDC_10
36,3
1,82
1,08
UNDC_11
35,7
1,83
1,4
UNDC_12
29,7
1,78
0,98
UNDC_13
27,1
1,83
1,19
UNDC_14
30,8
1,79
1,23
.Figura 1. Visualización del ADN genómico de aislamientos de Bacillus spp.
mediante gel de agarosa al 1 %.
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3.3. Amplificación por PCR con el gen 16S rRNA
y secuenciamiento.
Los productos de la amplificación PCR de las 14
muestras se analizaron la técnica de gel agarosa
al 1.5% para el análisis electroforético y se
observaron amplicones con un peso esperado
de 1500 pb. Como resultado del
secuenciamiento se obtuvieron 14
electroferogramas los cuales fueron analizados
posteriormente.
Figura 2. Visualización en gel de agarosa al 1,5 % de fragmentos
amplificados por PCR correspondientes a aislamientos de Bacillus spp.
3.4. Análisis bioinformático
De acuerdo al análisis de identificación
molecular con la plataforma BLAST, se
identificación, las especies de B. subtilis, B.
licheniformis, B. paralicheniformis y B. cereus,
con un mínimo de 92,05% y máximo de 100 %
de similitud.
La construcción del árbol filogenético revela la
relación evolutiva y homología entre las 14
cepas trabajadas.
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Tabla 2. Identificación molecular mediante el gen 16S RNAr con la plataforma BLAST.
Procedencia
Código de aislamiento
Especie identificada
Porcentaje de identidad
Huaura
UNDC_1
B. subtilis
98,85 %
Huaura
UNDC_2
B. subtilis
95,78 %
Huaura
UNDC_3
B. subtilis
98,08 %
Huaura
UNDC_4
B. subtilis
100,00 %
Huaura
UNDC_5
B. licheniformis
98,17 %
Huaura
UNDC_6
B. paralicheniformis
95,37 %
Huaura
UNDC_7
B. cereus
99,78 %
Chanchamayo
UNDC_8
B. licheniformis
92,04 %
Chanchamayo
UNDC_9
B. subtilis
99,55 %
Chanchamayo
UNDC_10
B. subtilis
98,22 %
Chanchamayo
UNDC_11
B. subtilis
97,89 %
Chanchamayo
UNDC_12
B. licheniformis
97,14 %
Lunahuaná
UNDC_13
B. subtilis
94,03 %
Lunahuaná
UNDC_14
B. licheniformis
98,90 %
Figura 3. Árbol filogenético con el uso del cebador 16S RNAr
4. Discusión
En la etapa de colecta se utilizó como muestra
el suelo rizosférico de fresa para la obtención de
las cepas de Bacillus spp, similar a un trabajo
reportado en rizósfera de cactáceas (Chávez-
Ambriz et al., 2016; Galvis & Moreno, 2014), por
el contrario se han realizado estudios donde
obtienen muestras de ácaros (Erban et al.,
2009), vegetales (Koilybayeva et al., 2023;
Rovira, 2014), peces (Feria Zevallos et al., 2019),
aves, bovinos (Florido et al., 2017), hongos (Liu
et al., 2020) entre otros. En este trabajo se
utiliza el suelo rizosférico por la alta diversidad
de microbiota y las condiciones ambientales
que propician el desarrollo del género Bacillus
spp por su estrecha relación con las raíces de los
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cultivos vegetales. (Rodríguez-Sahagún et al.,
2020)
En la etapa de amplificación por PCR se
utilizaron los cebadores universales del gen 16S
RNAr (Abdulsalam et al., 2023) sin embargo
otros autores utilizaron cebadores distintos
como Bc-Rep-1, Bc-Rep-2 (Galvis & Moreno,
2014) y M-B1 (Galvis & Carrillo, 2015).
El secuenciamiento de tipo sanger que se utilizó
en este trabajo fue eficiente para la
identificación molecular, sin embargo, se puede
mejorar los resultados utilizando
secuenciamiento de tercera generación como la
tecnología de Oxford Nanopore Technologies
(Ciuffreda et al., 2021), su mayor ventaja es la
longitud de lectura y la rapidez del proceso
(Kumburu et al., 2023). Esto nos permitirá
ampliar la base de datos, teniendo más puntos
de muestreo y repeticiones de los mismos.
La caracterización molecular de especies fue de
B. subtilis (Elegbeleye & Buys, 2020), B.
licheniformis (Romo-Barrera et al., 2021), B.
paralicheniformis (Du et al., 2019), B. cereus (Liu
et al., 2020), a diferencia de otros autores que
encontraron otro tipo de especies como B.
amyloliquefaciens, B. vallismortis, B
halotolerans (Ying et al., 2022), B. thuringiensis
(Rovira, 2014).
Finalmente el análisis filogenético permitió
obtener el árbol mediante la aplicación del
método de Neighbour Joining, alineado con el
programa Clustal X y con los valores de
bootstraps de 1000 replicaciones, similar al
trabajo reportado de (Rovira, 2014; Wei Wang,
2009), sin embargo estos parámetros se
pueden mejorar aumentando el número de
cebadores para el gen 16S RNAr y el número de
replicaciones utilizando un servidor
especializado para análisis bioinformáticos.
5. Conclusiones
La caracterización molecular del género Bacillus
spp. a través del análisis del gen 16S RNAr
permitió la identificación de 1 cepa de Bacillus
cereus, 1 cepa de Bacillus paralicheniformis, 4
cepas de Bacillus licheniformis y 8 cepas de
Bacillus subtilis; con un mínimo de 92,05% y
máximo de 100 % de similitud en las regiones
de Huaura, Chanchamayo y Cañete.
Agradecimientos
Se agradece a la Universidad Nacional de
Cañete por brindar las facilidades y el acceso
necesarios para la publicación del artículo de
revisión en su repositorio institucional, así
como por fomentar el desarrollo de la
investigación estudiantil.
Declaración de consentimiento informado
Todos los participantes otorgaron su
consentimiento informado de manera
voluntaria antes de su inclusión en la
investigación.
Conflictos de interés
No se declara ningún conflicto de interés en
relación con el presente estudio.
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